Curcumin decreases astrocytic reaction after gliotoxic injury in the rat brainstem / Curcumina reduz a reação astrocitária após injúria gliotóxica no tronco encefálico de ratos

ABSTRACT Recent studies have demonstrated that curcumin (Cur) has antioxidant, anti-inflammatory and anti-fibrotic effects. Ethidium bromide (EB) injections into the central nervous system (CNS) are known to induce local oligodendroglial and astrocytic loss, resulting in primary demyelination and neuroinflammation. Peripheral astrogliosis is seen around the injury site with increased immunoreactivity to glial fibrillary acidic protein (GFAP). This investigation aimed to evaluate the effect of Cur administration on astrocytic response following gliotoxic injury. Wistar rats were injected with EB into the cisterna pontis and treated, or not, with Cur (100 mg/kg/day, intraperitoneal route) during the experimental period. Brainstem sections were collected at 15, 21 and 31 days after EB injection and processed for GFAP immunohistochemical staining. Astrocytic reactivity was measured in a computerized system for image analysis. In Cur-treated rats, the GFAP-stained area around the lesion was significantly smaller in all periods after EB injection compared to untreated animals, showing that Cur reduces glial scar development following injury.

RESUMO Estudos recentes têm demonstrado que a curcumina (Cur) possui efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e antifibróticos. Sabe-se que a injeção de brometo de etídio (EB) no sistema nervoso central induz a perda oligodendroglial e astrocitária, resultando em desmielinização primária e neuroinflamação. Astrogliose periférica é observada ao redor da lesão com aumento da imunorreatividade à proteína glial fibrilar ácida (GFAP). A presente investigação objetivou avaliar o efeito da Cur sobre a resposta astrocitária após injúria gliotóxica. Ratos Wistar foram injetados com EB na cisterna basal e tratados ou não com Cur (100 mg/kg/dia, via intraperitoneal) durante o período experimental. Amostras do tronco encefálico foram coletadas aos 15, 21 e 31 dias pós-injeção de EB e processadas para estudo imuno-histoquímico para a GFAP. A reatividade astrocitária foi medida em um sistema computadorizado para análise de imagem. Nos ratos tratados com Cur, a área marcada para GFAP foi significantemente menor em todos os períodos pós-injeção de EB, indicando que a Cur reduz o desenvolvimento da cicatriz glial após injúria.

Propentofylline reduces glial scar development following gliotoxic damage in the rat brainstem / Propentofilina reduz o desenvolvimento da cicatriz glial após dano gliotóxico no tronco encefálico de ratos

ABSTRACT Propentofylline is a xanthine derivative that depresses activation of glial cells, whose responses contribute to neural tissue damage during inflammation. Ethidium bromide injection into the central nervous system induces local oligodendroglial and astrocytic loss, resulting in primary demyelination, neuroinflammation and blood-brain barrier disruption. Surviving astrocytes present a vigorous reaction around the injury site with increased immunoreactivity to glial fibrillary acidic protein (GFAP). Objective This study aimed to evaluate the effect of propentofylline administration on astrocytic response following gliotoxic injury. Method Wistar rats were injected with ethidium bromide into the cisterna pontis and treated or not with propentofylline (12.5mg/kg/day, intraperitoneal) during the experimental period. Brainstem sections were collected from 15 to 31 days after gliotoxic injection and processed for GFAP immunohistochemistry. Results and Conclusion Results demonstrate that propentofylline decreased astrocytic activation until the 21st day, suggesting that this drug may have a role in reducing glial scar development following injury.

RESUMO A propentofilina é uma xantina que deprime a ativação das células gliais, cujas respostas contribuem para o dano neural durante inflamação. A injeção de brometo de etídio no sistema nervoso central induz a perda oligodendroglial e astrocitária, resultando em desmielinização, neuroinflamação e ruptura da barreira hematoencefálica. Os astrócitos sobreviventes apresentam vigorosa reação ao redor da lesão com aumento da imunorreatividade à proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Objetivo Este estudo objetivou avaliar o efeito da propentofilina sobre a resposta astrocitária após injúria gliotóxica. Método Ratos Wistar foram injetados com brometo de etídio na cisterna basal e tratados ou não com propentofilina (12.5mg/kg/dia, intraperitoneal). Amostras do tronco encefálico foram coletadas dos 15 aos 31 dias pós-injeção do gliotóxico e processadas para estudo ultraestrutural e imuno-histoquímico para GFAP. Resultados e Conclusão Os resultados demonstram que a propentofilina reduziu a ativação astrocitária até o 21o dia, sugerindo que essa droga pode atuar na redução da cicatriz glial após injúria.

Excretion product of shigella dysenteriae (sdyep) induced cell death in early larval stage of zebrafish (danio rerio): acridine orange and ethidium bromide (AO/EB) in vivo staining / Producto de excreción de shigella dysenteriae (pesdy) induce muerte celular en larvas de pez cebra (danio rerio): marcaje in vivo con naranja de acridina y bromuro de etidio (NA/BE)

In the field of studies of acute toxicity induced by bacterial agents, Shiga toxins have been relevant due to the severity of the extra-intestinal diseases they cause. Numerous studies have shown that Shiga toxin induced apoptosis in different cell types; however, this important process has been little studied in vivo experimental models. In this study, the effects of excretion products of Shigella dysenteriae, in which Shiga toxin is present, were investigated on early larval stages of Zebrafish, an animal model with many advantages over other in vivo experimental models traditionally used. Both the collection of eggs and larvae of Zebrafish, and the product from excretion from Shigella dysenteriae (SdyEP) were performed according to laboratory standards. Also, toxicity bioassay, larvae treatment with pure and diluted solution, 10-1, 10-2, 10-3 , 10-4 and 10-5, v/v SdyEP and cell death in vivo using Acridine Orange (AO) and Ethidium Bromide (EB) were applied. The excretion product of Shigella dysenteriae (SdyEP) effect was expressed in terms of larval mortality and dependent dilution rather than incubation time. The larval population surviving treatment with Shigella excretion product presents severe morphological effects. The larval population generally presents notable severe morphological damage, the necrosis state is represented by the opacity of the larvae after being treated for 24 h (b) compared to control. Other changes associated with larval anatomy were also observed; particularly the caudal end curvature was significant into 10%. The use of AO/EB revealed a distribution pattern from fluorescence into green and orange in surviving larvae SdyEP poisoning, there was a large population of dead cells around the anal and caudal region as evidenced by the presence of orange nuclei in greater numbers as controls in the larvae. The results support the application of coloring AO/EB in Zebrafish experimental models for the evaluation of the toxic action of new molecules and new products with therapeutic potential.

En el campo de los estudios de toxicidad aguda inducida por agentes bacterianos, las toxinas Shiga resultan relevantes debido a la severidad de las enfermedades extra-intestinales que causan. Numerosos estudios han demostrado que la toxina Shiga induce la apoptosis en diferentes tipos de células, sin embargo, este importante proceso ha sido poco estudiado en modelos experimentales in vivo. En este estudio, fueron evaluados los efectos del productos de excreción de Shigella dysenteriae (PESdy), sobre estadios larvarios de pez cebra (Danio rerio), un modelo animal con muchas ventajas sobre otros modelos experimentales in vivo utilizados tradicionalmente. Tanto la recolección de los huevos y larvas de pez cebra, así como la obtención del producto de la excreción, se realizaron de acuerdo a los estándares de laboratorio. Poblaciones larvarias, fueron tratadas con distintas soluciones; pura y diluidas, 101, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5, v/v de PESdy. La muerte celular in vivo, usando naranja de acridina (NA) y bromuro de etidio (BE) fue evaluada. El efecto del SdyEP, se expresó como dependiente de la concentracion y del tiempo de exposición. La población de larvas sobrevivientes, presentaron curvatura troncal en un 10%, en relación a los controles. La necrosis se puso en evidencia a través de la opacidad de las larvas después de 24 h. El uso de NA/BE reveló un patrón de distribución de la fluorescencia en verde y naranja en larvas sobrevivientes al tratamiento. Una granpoblación de células muertas, alrededor de la región anal y caudal, se ponen en evidencia por la presencia de núcleos de naranja en mayor número que en los controles. Los resultados apoyan la aplicación de la coloración NA/BE en modelo experimental de pez cebra, para la evaluación de la acción tóxica de nuevas moléculas y nuevos productos de excreción bacterial con potencial terapéutico.

Excretion product of shigella dysenteriae (sdyep) induced cell death in early larval stage of zebrafish (danio rerio): acridine orange and ethidium bromide (ao/eb) in vivo staining / El producto de excreción de la shigella dysenteriae (pesdy) Induce muerte celular en larvas de pez cebra (danio rerio): marcaje in vivo con naranja de acridina y bromuro de etidio (na/be)

In the field of studies of acute toxicity induced by bacterial agents, Shiga toxins have been relevant due to the severity of the extra-intestinal diseases they cause. Numerous studies have shown that Shiga toxin induced apoptosis in different cell types; however, this important process has been little studied in vivo experimental models. In this study, the effects of excretion products of Shigella dysenteriae, in which Shiga toxin is present, we investigated on early larval stages of Zebrafish, an animal model with many advantages over other in vivo experimental models traditionally used. Both the collection of eggs and larvae of Zebrafish, and the product from excretion from Shigella dysenteriae (SdyEP) were performed according to laboratory standards. Also, toxicity bioassay, larvae treatment with pure and diluted solution, 10-1, 10-2, 10-3 , 10-4 and 10-5 v/v SdyEP and cell death in vivo using Acridine Orange (AO) and Ethidium Bromide (EB) were applied. The excretion product of Shigella dysenteriae (SdyEP) effect was expressed in terms of larval mortality and dependent dilution rather than incubation time. The larval population surviving treatment with Shigella excretion product presents severe morphological effects. The larval population generally presents notable severe morphological damage, the necrosis state is represented by the opacity of the larvae after being treated for 24 h (b) compared to control. Other changes associated with larval anatomy were also observed; particularly the caudal end curvature was significant into 10%. The use of AO/EB revealed a distribution pattern from fluorescence into green and orange in surviving larvae SdyEP poisoning, there was a large population of dead cells around the anal and caudal region as evidenced by the presence of orange nuclei in greater numbers as controls in the larvae. The results support the application of coloring AO/EB in Zebrafish experimental...

En el campo de los estudios de toxicidad aguda inducida por agentes bacterianos, las toxinas Shiga resultan relevantes debido a la severidad de las enfermedades extra-intestinales que causan. Numerosos estudios han demostrado que la toxina Shiga induce la apoptosis en diferentes tipos de células, sin embargo, este importante proceso ha sido poco estudiado en modelos experimentales in vivo. En este estudio, fueron evaluados los efectos del productos de excreción de Shigella dysenteriae (PESdy), sobre estadios larvarios de pez cebra (Danio rerio), un modelo animal con muchas ventajas sobre otros modelos experimentales in vivo utilizados tradicionalmente. Tanto la recolección de los huevos y larvas de pez cebra, así como la obtención del producto de la excreción, se realizaron de acuerdo a los estándares de laboratorio. Poblaciones larvarias, fueron tratadas con distintas soluciones; pura y diluidas, 10-1, 10-2, 10-3 , 10-4 and 10-5 v/v de PESdy. La muerte celular in vivo, usando naranja de acridina (NA) y bromuro de etidio (BE) fue evaluada. El efecto del PESdy, se expresó como dependiente de la concentración y del tiempo de exposición. La población de larvas sobrevivientes, presentaron curvatura troncal en un 10 por ciento, en relación a los controles. La necrosis se puso en evidencia a través de la opacidad de las larvas después de 24 h. El uso de NA/BE reveló un patrón de distribución de la fluorescencia en verde y naranja en larvas sobrevivientes al tratamiento. Una gran población de células muertas, alrededor de la región anal y caudal, se ponen en evidencia por la presencia de núcleos de naranja en mayor número que en los controles. Los resultados apoyan la aplicación de la coloración NA/BE en modelo experimental...

Decreased astrocytic GFAP expression in streptozotocin-induced diabetes after gliotoxic lesion in the rat brainstem / Expressão astrocitária diminuída de GFAP no diabetes induzido por estreptozotocina após lesão gliotóxica no tronco encefálico de ratos

OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of diabetic hyperglycemia on astrocyte function, estimated by means of glial fibrillary acidic protein - GFAP - immunohistochemical expression. MATERIALS AND METHODS: Adult male rats received a single intravenous injection of streptozotocin (50 mg/kg) and were submitted 10 days later to a single injection of 10 microlitres 0.1% EB solution or 0.9% saline solution into the cisterna pontis. Ten microliters of 0.1% EB or 0.9% saline solution were also injected in non-diabetic rats. Animals were anesthetized and perfused through the heart 15 and 31 days after EB or saline injection, and brainstem sections were collected for ultrastructural analysis and GFAP immunohistochemical staining. RESULTS: The GFAP brown-stained areas were evaluated by colorimetry using a computerized image analysis system and the results have shown that diabetes hindered the increase of GFAP astrocyte expression in the EB-injected group compared to non-diabetic animals. However, diabetes did not affect GFAP response in the saline-injected group or in control animals. CONCLUSION: Streptozotocin-induced diabetic condition reduced astrocytic GFAP expression following gliotoxic injury.

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da hiperglicemia na função astrocitária, estimada pela expressão imuno-histoquímica da proteína glial fibrilar ácida - GFAP. MATERIAIS E MÉTODOS: Ratos machos adultos receberam uma injeção intravenosa única de estreptozotocina (50 mg/kg) e foram submetidos, 10 dias após, à injeção de 10 microlitros de solução de BE 0,1% ou de salina 0,9% na cisterna pontina. Dez microlitros de BE 0,1% ou salina 0,9% foram também injetados em ratos não diabéticos. Os animais foram anestesiados e perfundidos por via intracardíaca aos 15 e 31 dias pós-injeção de BE ou salina, e amostras de tronco encefálico foram coletadas para estudo ultraestrutural e análise imuno-histoquímica para a GFAP. RESULTADOS: Utilizando um sistema computadorizado de análise de imagens, os resultados das áreas coradas em marrom pela GFAP, medidas por colorimetria, mostram que o diabetes reduziu o aumento de expressão dessa proteína no grupo injetado com BE em comparação aos animais não diabéticos, mas não alterou a resposta no grupo injetado com salina ou nos controles diabéticos. CONCLUSÃO: O estado diabético induzido pela estreptozotocina reduziu a expressão astrocitária de GFAP após dano gliotóxico.

Blood-brain barrier breakdown and repair following gliotoxic drug injection in the brainstem of streptozotocin-diabetic rats / Ruptura e reparo da barreira hematoencefálica pós-injeção de droga gliotóxica no tronco encefálico ratos diabéticos

Ethidium bromide (EB) causes local astrocytic disappearance, with glia limitans disruption and blood-brain barrier (BBB) breakdown. The aim of this study was to evaluate the BBB integrity after the injection of 0.1 percent EB or 0.9 percent saline solution into the cisterna pontis of Wistar rats submitted or not to the streptozotocin diabetogenic model. Brainstem sections were collected from 24 hours to 31 days post-injection for ultrastructural analysis and glial fibrillary acidic protein immunohistochemical staining. Some animals received colloidal carbon ink by intravenous route at the same periods. In rats injected with EB, results revealed astrocyte disappearance and leakage of carbon particles beginning at 48 hours and persisting for 7 days in non-diabetic rats and for 15 days in the diabetic ones, although, in both groups, several areas remained devoid of astrocytic processes up to 31 days. In rats injected with saline, there was no sign of astrocytic loss or carbon particles leakage.

O brometo de etídio (BE) determina o desaparecimento local de astrócitos, com ruptura da glia limitans e dano na barreira hematoencefálica (BHE). Este estudo visou avaliar a integridade da BHE após injeção de solução de BE a 0,1 por cento ou de salina a 0,9 por cento na cisterna pontis de ratos Wistar submetidos ou não ao modelo diabetogênico da estreptozotocina. Fragmentos do tronco encefálico foram coletados das 24 horas aos 31 dias pós-injeção para estudo ultraestrutural e marcação imuno-histoquímica para proteína glial fibrilar ácida. Alguns animais receberam carvão coloidal por via intravenosa nos mesmos períodos. Nos grupos injetados com BE, os resultados mostraram desaparecimento astrocitário e extravasamento de partículas de carvão nas lesões a partir das 48 horas, persistindo por até sete dias nos animais não diabéticos e 15 dias nos diabéticos, embora, em ambos os grupos, diversas áreas permanecessem destituídas de astrócitos até 31 dias após. Nos ratos injetados com salina, diabéticos ou não, não houve sinal de perda astrocitária nem de extravasamento vascular de carvão.

Semi-quantitative analysis of the effects of cyclosporine on remyelination following gliotoxic injection in the brainstem / Análise semiquantitativa dos efeitos da ciclosporina na remielinização após injeção gliotóxica no tronco encefálico

The use of cyclosporine (CsA) has shown to induce an increase in the density of oligodendrocytes near remyelinating areas following the injection of ethidium bromide (EB), a demyelinating agent, in the rat brainstem. This study was designed in order to evaluate if CsA has the capacity of increasing remyelination. In this context, a comparison between the final balance of myelin repair in CsA treated and non-treated rats was assessed using a semi-quantitative method developed for documenting the extent and nature of remyelination in gliotoxic lesions. Wistar rats were submitted to intracisternal injection of 10 microliters of 0.1 percent EB. Some were treated during 31 days with CsA (group III - 10 mg/kg/day by 7 days and, thereafter, 3 times a week, with a minimal interval of 48 hours) by intraperitonial route. Others were not treated with CsA (group I). A control group was planned receiving into the cisterna pontis 10 microliters of 0.9 percent saline solution and following after that the same CsA administration protocol (group II). Results clearly demonstrate that in vivo administration of CsA after EB-demyelinating lesions stimulated oligodendrocyte remyelination (mean remyelination scores of 3.72±0.25 for oligodendrocytes and 1.04±0.39 for Schwann cells) compared to non-treated animals (3.13±0.71 and 1.31±0.62, respectively), although the mechanisms by which this positive CsA effect occurs are unclear.

O uso de ciclosporina (CsA) mostrou induzir um aumento na densidade de oligodendrócitos próximos a áreas de remielinização após injeção de brometo de etídio (EB), um agente desmielinizante, no tronco encefálico de ratos. Este estudo foi desenvolvido a fim de avaliar se a CsA possui a capacidade de acelerar a remielinização. Neste contexto, foi feita uma comparação entre o balanço final de reparo mielínico em ratos tratados ou não com CsA usando-se um método semiquantitativo desenvolvido para documentação da extensão e natureza da remielinização em lesões gliotóxicas. Ratos Wistar foram submetidos à injeção intracisternal de EB a 0,1 por cento. Alguns foram tratados durante 31 dias com CsA (grupo III - 10 mg/kg/dia por 7 dias e, após, 3 vezes por semana, com um intervalo mínimo de 48 horas entre as aplicações) por via intraperitoneal. Outros não foram tratados com CsA (grupo I). Um grupo controle foi desenvolvido recebendo, na cisterna pontina, 10 microlitros de solução salina e seguindo após o mesmo protocolo de administração de CsA (grupo II). Os resultados mostram claramente que a administração in vivo de CsA após lesões desmielinizantes induzidas pelo EB estimulou a remielinização por oligodendrócitos (escores médios de remielinização de 3,72±0,25 para oligodendrócitos e 1,04±0,39 para células de Schwann) em comparação aos animais não-tratados (3,13±0,71 e 1,31±0,62, respectivamente), embora os mecanismos pelos quais este efeito positivo da CsA ocorre sejam desconhecidos.

Schwann cell expression of an oligodendrocyte-like remyelinating pattern after ethidium bromide injection in the rat spinal cord / Expressão pelas células de Schwann de um padrão de remielinização semelhante ao oligodendroglial após injeção de brometo de etídio na medula espinhal de ratos

Schwann cells are recognized by their capacity of producing single internodes of myelin around axons of the peripheral nervous system. In the ethidium bromide (EB) model of primary demyelination in the brainstem, it is observed the entry of Schwann cells into the central nervous system in order to contribute to the myelin repair performed by the oligodendrocytes that survived to the EB gliotoxic action, being able to even remyelinate more than one axon at the same time, in a pattern of repair similar to the oligodendroglial one. The present study was developed in the spinal cord to observe if Schwann cells maintained this competence of attending simultaneously different internodes. It was noted that, on the contrary of the brainstem, Schwann cells were the most important myelinogenic cells in the demyelinated site and, although rare, also presented the capacity of producing more than one internode of myelin in distinct axons.

As células de Schwann são reconhecidas por sua capacidade de produzir internodos de mielina únicos ao redor de axônios do sistema nervoso periférico. No modelo de desmielinização primária do brometo de etídio (BE) no tronco encefálico, tem sido observada a entrada destas células no sistema nervoso central. Isso pode contribuir para o reparo mielínico desempenhado pelos oligodendrócitos que sobreviveram à ação glitóxica do BE, chegando a remielinizar mais de um axônio ao mesmo tempo, em um padrão de reparo semelhante ao oligodendroglial. O presente estudo foi realizado na medula espinhal para observar se as células de Schwann mantinham esta competência de atender simultaneamente diferentes internodos. Foi observado que, ao contrário do tronco encefálico, as células de Schwann foram as células mielinogênicas mais importantes no sítio de desmielinização induzida pelo BE e, embora raro, também apresentaram a capacidade de produzir mais de um internodo de mielina em axônios distintos.

Ultrastructural study of the effects of cyclosporine in the brainstem of Wistar rats submitted to the ethidium bromide demyelinating model / Estudo ultra-estrutural dos efeitos da ciclosporina no tronco encefálico de ratos Wistar submetidos ao modelo desmielinizante do brometo de etídio

The ethidium bromide-demyelinating model (EB) was used to study remyelination in the brainstem under the use of cyclosporine (CsA). Wistar rats were submitted to intracisternal injection of 0.1 percent EB or 0.9 percent saline solution, and others were taken as histologic controls (group I). Within those injected with EB, some have not received immunosuppressive treatment (II); some were treated by intraperitonial route with CsA (III.E - 10 mg/kg/day). Rats from group III.C were injected with saline solution and treated with CsA. The animals were perfused from 15 to 31 days post-injection collecting brainstem sections for light and transmission electron microscopy studies. After EB injection it was noted the presence of macrophages and non-degraded myelin debris, demyelinated axons, oligodendrocyte or Schwann cell remyelinated axons, groups of infiltrating pial cells, hypertrophic astrocytes and few lymphocytes. Tissue repair of EB-induced lesions in group III.E was similar to that of group II, but with the presence of a higher density of oligodendrocytes near remyelinating areas.

Empregou-se o modelo desmielinizante do brometo de etídio (BE) com o objetivo de estudar a remielinização no tronco encefálico frente ao uso de ciclosporina (CsA). Foram utilizados ratos Wistar, submetidos à injeção de BE a 0,1 por cento ou de solução salina na cisterna pontina, assim como controles histológicos (grupo I). Dos animais injetados com BE, alguns não receberam tratamento imunossupressor (II); outros foram tratados por via intraperitoneal com CsA (III.E - 10 mg/kg/dia). O grupo III.C incluiu animais injetados com salina e tratados com CsA. Os animais foram perfundidos dos 15 aos 31 dias pós-injeção, com colheita de material do tronco encefálico para estudos de microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Após injeção de BE, foram observados macrófagos e restos de mielina não-degradada, axônios desmielinizados ou remielinizados por oligodendrócitos e por células de Schwann, grupos de células piais infiltrantes, astrócitos hipertróficos e poucos linfócitos. O processo de reparo das lesões no grupo III.E apresentou-se similar ao do grupo II, porém com maior densidade de oligodendrócitos próximos às áreas de remielinização.

Influência da lesão mitocondrial na atividade e expressão de NAD(P)H oxidase da membrana celular em células musculares lisas vasculares / Influence of mitochondrial DNA damage on NAD(P)H oxidase activity and expression in vascular smooth muscle cells

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1...

Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however...

Evaluación y mejoramiento del ensayo inmunoenzimático (ELISA) para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina, utilizando las MSP5 recombinante como antígeno / Evaluation and improvement of an immunoenzimatic assay (ELISA) for diagnosis of bovine anaplasmosis, using recombinant MSP5 as antigen

La anaplasmosis, es una enfermedad producida por la bacteria Anaplasma marginale que está ampliamente distribuida en Venezuela, originando efectos negativos en la salud y productividad de los rebaños bovinos. Hasta el presente se han caracterizado 6 proteínas mayoritarias de superficie (MSP) de esta bacteria, de las cuales la MSP5, ha sido señalada como un excelente polipéptido para el diagnóstico de la enfermedad, debido a que esta proteína es altamente conservada e inmunogénica. Esto ha motivado su clonamiento e inserción en un plásmido de E. coli, para usarla purificada como antígeno en ensayos inmunoenzimáticos. Sin embargo, estudios posteriores, indican que proteínas de E. coli recombinante que eluyen conjuntamente con la MSP5 durante el proceso de purificación, interfieren en el ELISA originando falsos positivos. En el presente trabajo se estandarizó un ELISA indirecto, utilizando la MSP5 como antígeno y se logró disminuir las uniones inespecíficas a las proteínas contaminantes de E. coli, por adición de un suero de conejo anti E. coli que bloquea los epítopes de estas proteínas. A través de un cuadro de contingencia de doble entrada, se determinaron los parámetros de validación del ELISA al compararla con la técnica de naranja de acridina-bromuro de etídio, obteniéndose como resultado que la técnica de ELISA mejorada es 96,1 por ciento sensible, 9 por ciento específica y presenta un valor predictivo del 88,6 por ciento. Además, se estudió una población bovina de 48 mautes de la Estación Experimental La Iguana (estado Guárico), utilizando ambas técnicas, obteniendo una seroprevalencia de 93,7 por ciento por ELISA y una prevalencia de 54,1 por ciento por naranja de acridina-bromuro de etidio. Estos resultados muestran que el bloqueo de los epítopes de las proteínas de E. coli contaminates, utilizando para ello un suero de conejo anti-E. coli, permite disminuir los falsos negativos cuando se utilizan proteínas recombinantes.

Anaplasmosis, is a disease produced by Anaplasma marginale widely distributed in Venezuela, causing negative effects on the health and productivity of bovine herds. Until now, 6 constitutive Anaplasma marginale Mayor Surface Proteins (MSPs) have been characterized, including MSP5 which appears to be an excellent polypeptide for the diagnosis of this disease since it is highly conserved and immunogenic. This has motivated its cloning and insertion into a plasmid in E. coli and the use of the purified antigen in immunoenzymatic assays. However, subsequent indicated that E. coli recombinant proteins, that copurify with MSP5, interfere with the ELISA giving rise to false positives. In the present study, it was accomplished the standardization of an indirect ELISA, using MSP5 as the antigen and it was also diminishing the non-specific unions to the contaminating proteins of E. coli by adding anti-E. coli rabbit serum that blocks the epitopes of these proteins. With the use of a double entry contingency table, the parameters of validation of the ELISA were determined, comparing it to the acridine orange-ethidium bromide technique. The result indicate that the improve MSP5 indirect ELISA has a 96.1% sensitivity, 9% specificity and a predictive value of 88.6%. It was also studied a bovine population of 48 cattle from the Experimental Station “La Iguana” (Guárico State), using both techniques, obtaining a seroprevalence of 93.7% with ELISA and a prevalence of 54.1% with orange acridine-ethidium bromide. These results show that the blockage of the contaminating E. coli protein epitopes using an anti-E. coli rabbit serum permits the diminishment of false negatives when using recombinant proteins.